|
INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA archivo del portal de recursos
para estudiantes |
Curso de Doctorado "Biotecnología, ética y sociedad"
Enrique Iáñez Pareja
Instituto de Biotecnología Universidad de Granada, España
Sumario:
1. Concepto y breve historia de la biotecnología
1.1. La biotecnología es intrínsecamente interdisciplinar
2. Algunos conceptos clave en biotecnologías
2.2 Mejora genética: ingeniería genética
2.2.1 Antecedentes y surgimiento de la Ingeniería Genética
2.2.2 La receta básica de un experimento de Ingeniería Genética
2.2.3 Caracterización del ADN clonado
2.2.4 Otros métodos básicos de Ingeniería genética
1. Concepto y breve historia de la biotecnología
La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios.
Esto significa que desde hace miles de años, la humanidad ha venido realizando biotecnología, si bien hasta la época moderna, de un modo empírico, sin base científica:
La domesticación de plantas y animales ya comenzó
en el período Neolítico.
Las civilizaciones Sumeria y Babilónica (6000 años a.C.) ya
conocían cómo elaborar cerveza.
Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000
a.C.
Antes de la escritura del libro del Génesis, se disfrutaba
del vino en el Cercano Oriente: recuérdese que, según la Biblia,
Noé "sufrió" (o disfrutó) accidentalmente
los efectos de la fermentación espontánea del mosto de la
uva (primera borrachera con vino).
Otros
procesos biotecnológicos conocidos de modo empírico desde
la antigüedad:
fabricación de queso
cultivo de champiñones
alimentos
y bebidas fermentadas: salsa de soja, yogur, etc.
tratamiento de aguas residuales
Por supuesto, hasta la llegada de la moderna biología,
y en muchos casos hasta el siglo XIX, la base de muchos de estos procesos
era desconocida. De hecho, solamente en el siglo XVIII cobra cuerpo la idea
de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es
decir, usando el método experimental, con lo que se inicia el lento
declive de las ideas vitalistas (creencias erróneas de que "la
vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que aún
darían sus últimos estertores casi al final del siglo XIX.
Algunos hitos científicos que sentarían la base de la biotecnología
contemporánea:
Los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo
XVII) describen los "animálculos" que están fuera
del alcance del ojo, si bien se tarda aún un par de siglos en captar
la importancia de estas minúsculas criaturas.
El descubrimiento de que las fermentaciones se debían a
microorganismos se debe a la gigantesca figura de Louis Pasteur, en sus
estudios realizados entre 1857 y 1876.
En la última parte del siglo XIX existían ya instalaciones
industriales para obtener etanol, ácido acético, butanol y
acetona, aprovechando fermentaciones al aire libre en condiciones no estériles
A finales del siglo XIX, la "edad de oro de la bacteriología"
permite:
mejoras importantes en las técnicas
microscópicas
el desarrollo de técnicas asépticas,
la esterilización y la pasteurización
la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana
sin mezclas con otras: cultivos puros en medios de cultivo de laboratorio.
A comienzos del siglo XX la bioquímica y la microbiología
convergen, estableciendo las bases enzimáticas y metabólicas
de muchos procesos de fermentación. Se desarrollan procedimientos
industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.).
Desde la década de 1940, las técnicas de ingeniería
química, aliadas a la microbiología y a la bioquímica,
permiten la producción de antibióticos, ácidos orgánicos,
esteroides, polisacáridos y vacunas.
La penicilina comenzó a fabricarse en plena II Guerra Mundial,
como resultado de avances importantes en técnicas de esterilización
a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentación (incluyendo
la cuestión de la aireación), cultivo del hongo, etc. A partir
de entonces se diseñaron estrategias para mejorar genéticamente
las cepas microbianas industriales.
Las décadas siguientes fueron de eclosión de producción
de antibióticos así como de transformaciones de esteroides
y de cultivo de células animales para la producción de vacunas
antivirales.
Las décadas de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos
de obtención de pequeños metabolitos como nucleósidos,
aminoácidos y vitaminas.
Los procesos de fermentación experimentaron mejoras con
las técnicas de inmovilización de células y enzimas
en soportes, y con la fermentación continua para obtener proteína
de células sencillas (biomasa microbiana).
Polímeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron
industrialmente, con apliaciones en el campo de la alimentación (como
aditivos).
Pero incluso bien avanzado el siglo XX, cuando la Genética había resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que había para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), selección de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes físicos (rayos UV, rayos X) o químicos, con ulterior búsqueda (selección o rastreo -screening) de alguna variante de interés (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.
Debemos esperar a la década de los 70 para que surja un conjunto de técnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son técnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseños previos y objetivos concretos (de ahí el nombre popular de Ingeniería Genética).
La Ingeniería Genética (I.G.), mejor llamada tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho.
1.1. La
biotecnología es intrínsecamente interdisciplinar
La actual biotecnología
es una empresa intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunión
de conceptos y metodologías procedentes de numerosas ciencias para
aplicarlas tanto a la investigación básica como a la resolución
de problemas prácticos y la obtención de bienes y servicios.
Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnología:
Microbiología
Bioquímica
Genética
Biología celular
Química
Ingeniería (bio)química
Ingeniería mecánica
Ciencia y Tecnología de alimentos
Electrónica
Informática
El avance de la biotecnología dependerá cada vez más de esta colaboración entre disciplinas, y en el uso de lenguajes y paradigmas comunes, así como en que cada tipo de especialista comprenda los logros y limitaciones de las otras ramas biotecnológicas.
1.2. La biotecnología presenta muchos campos de aplicación
Dejando aparte el hecho ya reseñado de que las técnicas biotecnológicas (principalmente las genéticas) encuentran su primera utilidad en el avance de las propias Ciencias de la Vida, desde el punto de vista de su aplicación comercial e industrial, podemos decir que el campo de utilidad es inmenso:
Aplicaciones terapéuticas
productos farmacéuticos:
antibióticos
vacunas
hormonas
terapias génicas
Diagnósticos
diagnósticos para salud humana
diagnósticos para agricultura y ganadería
ensayos para calidad de alimentos
ensayos para calidad ambiental
Alimentación
mejora de procesos tradicionales de obtención de
alimentos y bebidas
nuevos alimentos
y bebidas
nutracéuticos:
alimentos con perfiles determinados de nutrientes, y para la mejora
de la salud
aditivos alimentarios
Medio ambiente
tratamiento de residuos urbanos, agrícolas e industriales
biorremedio y biorreparación
producción de energía a partir de biomasa
No podemos olvidar que muchas de las biotecnologías de las que nos beneficiamos son muy antiguas, y que en ellas se está logrando una fase de madurez auspiciada por los nuevos adelantos técnicos (p. ej., la tecnología de las fermentaciones). De hecho, muchas de las innovaciones que se están produciendo no son tanto de nuevos productos cuanto de mejoras en los procesos. De cualquier manera, ya estamos viendo la entrada de nuevos productos, en forma de nuevos fármacos y de plantas transgénicas con características novedosas.
Dejando aparte las tecnologías de fabricación de vacunas, la mayor parte de las otras áreas biotecnológicas requieren producir grandes cantidades de sustancias, del orden de kilogramos a toneladas, por lo que uno de los principales aspectos es el del "escalado" a esas grandes cantidades. Esto supone un gran reto a los ingenieros, ya que deben diseñar fermentadores de gran tamaño, donde hay que controlar diversos parámetros, como pH, temperatura, oxígeno y otros gases, etc. La tecnología de fermentación cobró ímpetu a partir de los años 40 del siglo XX, cuando se comenzaron a fabricar antibióticos y otras moléculas (ácidos orgánicos, hormonas, enzimas, polisacáridos, etc) por medio de microorganismos.
Por lo tanto, aunque la atención pública se ha centrado
en la moderna biotecnología que usa técnicas de ADN recombinante,
no podemos olvidar que ya antes existía otra biotecnología,
que hoy sigue pujante, y que se puede beneficiar de los nuevos enfoques.
Las biotecnologías, al usar catalizadores biológicos
que funcionan a bajas temperaturas y materias primas renovables, pueden
contribuir a una economía más "verde" (ecológicamente
sustentable). Se espera que puedan sustituir a procesos químicos
contaminantes.
En los paises con condiciones climáticas apropiadas (p.ej.,
en los trópicos), la producción y uso de biomasa puede presentar
muchas ventajas. La obtención de energía de biomasa (p ej.
residuos celulósicos) es una gran promesa para evitar la dependencia
de combustibles fósiles en ciertas partes del mundo.
Los altos costes (económicos y ecológicos) de las
energías tradicionales pueden suponer un incentivo para buscar en
la biotecnología procesos de producción más rentables.
Si además, se incluyen en los procesos industriales los costes ecológicos
(hasta ahora tenidos como "externalidades" por la teoría
económica tradicional), las alternativas de base biológica
pueden ser más favorables que muchas contaminantes que se están
empleando.
Los incentivos son aún mayores en el caso de la producción de sustancias de alto valor añadido, como diagnósticos y productos terapéuticos, para las que las biotecnologías permiten abrir nuevos mercados muy atractivos, con productos destinados a mejorar la salud y calidad de vida de la población.
1.3 Los tres núcleos de la biotecnología
Según John Smith (1996), muchos procesos biotecnológicos, especialmente los que se realizan en entornos cerrados industriales, tienen un triple núcleo:
obtener el mejor catalizador biológico para una función
o proceso específico
obtener el mejor ambiente para la función de ese catalizador
biológico, mediante una serie de diseños técnicos
en los que es fundamental la ingeniería química
procesamiento del material, consistente en separar y eventualmente purificar el material biológico producido
Veamos cada uno de estos tres componentes:
En la mayoría de los casos, el catalizador biológico
son células vivas, sobre todo microorganismos. Por ello, uno de los
pilares de la biotecnología es precisamente la microbiología
(entendiendo esta en sentido amplio de biología microbiana). Parte
de lo que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos se puede aplicar,
con modificaciones, al manejo de células de animales y plantas, que
cada vez son más importantes en la biotecnología. Varias son
las características que hacen atractivos a los microorganismos:
la biodiversidad microbiana es gigantesca; de hecho, solo hemos
investigado una pequeña parte de ella. Conforme los biólogos
básicos aprendan a recuperar más biodiversidad y a conocerla,
habrá más cepas disponibles con propiedades potencialmente
útiles para los humanos
las capacidades metabólicas de los microorganismos, como
conjunto, son las más amplias de todos los seres vivos. Los genomas
microbianos esconden tesoros aún ocultos, pero que se van revelando
poco a poco, y ahora de modo más rápido, una vez que se van
complentando sus mapas y secuencias (actualmente existen varias decenas
de genomas secuenciados). Las actividades biosintéticas y degradativas
de estos microorganismos presentan oportunidades extraordinarias para numerosas
aplicaciones.
los microorganismos crecen rápidamente, y en muchos casos
son fáciles de manipular desde el punto de vista genético.
Esto hace que sea relativamente fácil usarlos como factorías
microscópicas para obtener productos útiles en tiempos relativamente
cortos.
Una parte esencial del aprovechamiento de los microorganismos
reposa en nuestra capacidad para conservarlos viables durantes largos periodos
de tiempo, y para que sus características útiles sean estables
en muchos casos, en lugar del microorganismo, se puede recurrir
a aislar alguna o algunas de sus enzimas, y se las pueden poner a trabajar
en condiciones ventajosas y rentables.
El segundo componente o núcleo de las biotecnologías estriba en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las células o las enzimas. Esto nos lleva al concepto de biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que nuestros catalizadores biológicos hagan lo que queremos con la máxima eficiencia. En esta parte de la biotecnología se requiere la colaboración estrecha entre los biólogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros químicos. Se trata de diseñar biorreactores o fermentadores, especies de cubas cerradas diseñadas para controlar diversos parámetros que condicionan la buena producción: temperatura, aireación, pH, etc.
Finalmente, queda el área quizá más desconocida y compleja, el procesamiento de la biomasa o de la sustancia producidas: separación de las células respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperación eficiente del producto buscado, purificación, etc.
A todo esto tenemos que añadir que un factor importantísimo en el desarrollo de la biotecnología es la evaluación de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos según normativas nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnológicos. Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan más de lo que la evidencia científica sugiere, manteniendo en todo momento la preservación de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepción pública de los riesgos y promesas de la biotecnología. Por ejemplo, hoy en Europa la percepción pública ha logrado prácticamente una parada en las plantas transgénicas, a pesar de los informes científicos que dicen que en la mayor parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. Habrá que llegar a un diálogo racional entre los diversos actores (científicos, empresas, consumidores, ecologistas, etc), para asegurar el correcto empleo de estas tecnologías, que por un lado no impida aplicaciones benéficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos ámbitos donde las dudas razonables hagan recomendables más restricciones. El ideal sería permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presión que pueden esconder agendas políticas ocultas.
2. Algunos aspectos
clave en las biotecnologías
2.1 Materias primas
Las materias primas para alimentar los procesos biotecnológicos
industriales pueden ser muy variadas, pero el hecho de que en su mayoría
se trate de materias naturales biodegradables las hace muy atractivas. Lo
ideal sería emplear subproductos de otras empresas, con lo que el
proceso se abarata y se eliminan problemas ambientales:
se usan mucho
desechos ricos en carbohidratos de ciertas industrias:
melazas procedentes del procesamiento de caña de azúcar
y remolacha azucarera. En Brasil usan la caña de azucar para
fabricar bioalcohol (Gasohol) como biocombustible
desechos ricos en almidón: de granos como el maíz, de tubérculos como la tapioca o la patata. El problema aquí es que el almidón debe primero ser degradado a monosacáridos u oligosacáridos antes de la fermentación industrial, pero ciertos procesos biotecnológicos son ya competitivos, como la producción de jarabes ricos en glucosa o fructosa, usados como endulzantes en alimentos y bebidas. En Suecia eliminan los desechos contaminantes del procesamiento de la patata con un método a base de levaduras, que produce biomasa potencialmente valiosa.
Existe un gran interés en usar como materia prima desechos
agrícolas e industriales ricos en celulosa. Desgraciadamente, la
celulosa es compleja, y su asociación con la lignina hace que aún
no existan procesos industriales operativos. Pero si en un futuro logramos
superar las barreras técnicas, tendremos una materia prima abundante,
y podremos aprovecharla al tiempo que evitamos problemas ambientales. De
hecho, la lignocelulosa es la materia renovable más abundante de
la biosfera, y la esperanza es poder aprovecharla en un próximo futuro.
De la misma manera, sería estupendo poder aprovechar otros desechos de las actividades humanas como materias primas para los microorganismos industriales, elimando así problemas de polución ambiental. La idea sería acoplar una industria que crea efluentes contaminantes con una bioindustria que pueda aprovechar los residuos de la primera, creando productos útiles y riqueza adicional, y sin que los costes totales sean elevados (aunque ya el hecho de eliminar una fuente de contaminación de puede considerar como algo positivo)
ya se usan desechos procedentes de las industrias papeleras
igualmente se aprovechan los lactosueros (residuos ricos en lactosa) procedentes de las queserías
El empleo de metanol puede ser útil en ciertos procesos, ya que el metanol es "limpio" y se puede obtener fácilmente a partir del abundante metano. En un futuro podría ser rentable para fabricar alimentos para animales.
2.2 Mejora genética:
Ingeniería genética
Tradicionalmente, la manera de mejorar genéticamente
los organismos industriales reposaba en
la inducción de mutaciones
(con mutágenos), seguida de selección o rastreo de los mejores
mutantes. La búsqueda de mejoras en la producción de proteínas
(incluyendo enzimas) es más fácil que la de la producción
de otras moléculas (polisacáridos, antibióticos, aminoácidos,
etc), porque cada proteína depende normalmente de un solo gen, mientras
que los metabolitos se sintetizan por rutas complejas donde intervienen
varias enzimas, cada una sintetizada por un gen diferente, y con regulaciones
a menudo complicadas.
en
los protocolos de selección, se suele aplicar una presión
selectiva que favorece el crecimiento del tipo de mutantes buscados, en
detrimento del resto de microorganismos
en los protocolos de rastreo (screening, en inglés) crecen
todos los microorganismos, pero se pueden identificar las variantes deseadas
sobre la base de que presentan ciertas características que las diferencian
de las demás
la mezcla de genomas mediante fenómenos
de sexualidad, o parasexualidad (las bacterias no tienen sexo, pero algunas
tienen fenómenos parasexuales como la conjugación, que se
pueden aprovechar para transferir material genético de unas cepas
a otras).
Algunos inconvenientes de estas técnicas tradicionales de mejora:
los programas
de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a menudo no dan los resultados
deseados
el efecto principal
de la mutagénesis es originar mutaciones aleatorias en el organismo,
la mayor parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o empeoran
algunas de sus características originales. Raramente se dan mutaciones
que conducen a la aparición de propiedades nuevas positivas, y en
todo caso, el proceso de su búsqueda es a menudo muy complicado.
Además, incluso cuando se selecciona un tipo estimado adecuado, a
menudo presenta otras mutaciones que son negativas (p. ej., haciendo que
crezca más lentamente, o que sea más sensible a factores ambientales)
lo
anterior obliga a trasladar la mutación "positiva" a un
fondo genético distinto (normalmente una cepa silvestre o que ya
había sido seleccionada como buena en un programa anterior). Esto
complica y alarga la mejora genética, e incluso en algunos organismos
no se logra la adecuada introgresión de ese rasgo en la cepa deseada.
frecuentemente los organismos
seleccionados para la producción acumulan mutaciones desconocidas
que no se caracterizan
muchos microorganismos
industriales carecen de ciclos sexuales, lo que dificulta e incluso impide
transferir rasgos útiles de modo sencillo, dejando como única
alternativa la mutagénesis y selección
en las especies dotadas de sexualidad, la mejora por recombinación genética está limitada al cruce entre razas de la misma especie, o de especies compatibles
Pero la llegada de la Ingeniería genética ha supuesto la superación de muchos problemas que tenía la mejora clásica, sobre todo en aquellos microorganismos que carecen de sexualidad. Además, permite mejoras menos aleatorias y más precisas, transfiriendo genes de cualquier origen al organismo donde queremos expresarlos.
2.2.1 Antecedentes y
surgimiento de la Ingeniería Genética
Aunque la Genética es
la base de toda la Biología, su desarrollo como ciencia es de los
más tardíos. Veamos esquemáticamente algunos eventos
esenciales para entender el surgimiento de la tecnología del ADN
recombinante:
A partir de 1865, Mendel establece las bases de la genética.
En sus famosos experimentos con el guisante, descubrió el modo de
transmisión de ciertos caracteres desde una generación a las
siguientes, y su "mezcla" en el aporte materno y paterno.
Los hallazgos de Mendel permanecieron en el olvido hasta 1900, cuando sus
leyes son redescubiertas por Correns, De Vries y Tschermarck.
En 1909 se acuña el término "gen" (o gene) para
referirse a la entidad hipotética responsable de los rasgos observables.
En 1913 se obtiene el primer mapa genético, con 6 genes.
En 1920 Morgan y Muller establecen su Teoría cromosómica de
la herencia: los genes, localizados en los cromosomas, son las auténticas
unidades de la herencia, tanto unidades de variación como unidades
de transmisión. Es decir, la herencia presenta un doble aspecto:
el de la transmisión de los caracteres (estudiado por las leyes de
Mendel) y el de la expresión, es decir, el genotipo (conjunto de
genes) determina el fenotipo (rasgos observables).
Pero la naturaleza del material genético fue objeto de polémicas
durante mucho tiempo, hasta que entre los años 40 y primeros 50 una
serie de autores (Avery y colaboradores, Hershey y Chase, etc.) establecen
firmemente que el material de la herencia reside en el ácido desoxirribonucleico
(ADN; DNA).
Por esos mismos
años, Beadle y Tatum proponen la teoría conocida como "un
gen-una enzima", que correlaciona cada unidad genética con el
producto de su expresión, es decir cada gen se expresa como una determinada
proteína. Desde entonces, se produce la definitiva unión de
la genética con la bioquímica.
En 1945, Schrödinger escribe su influyente libro ¿Qué
es la vida?, una visionaria fusión de la
Teoría de la Información con la Biología, que iba a
contribuir poderosamente a la naciente biología molecular, inspirando
a profesionales procedentes del campo de las ciencias químico-físicas.
En los 40 y 50 se produce, en efecto, un "desembarco" de físicos
y cristalógrafos en el abordaje de cuestiones biológicas.
Es la época del florecimiento de técnicas como la difracción
de rayos X, la ultracentrifugación y la cromatografía.
En 1951 un joven biólogo estadounidense, James Watson, llega al laboratorio
Cavendish de la Universidad de Cambridge, para pasar una estadía
postdoctoral. Allí se une al inglés Francis Crick, y 18 meses
más tarde (primavera de 1953) publican en Nature su modelo tridimensional de la doble hélice del ADN.
El modelo explicaba simultáneamente la herencia y la expresión
del material genético. Éste consiste en un lenguaje basado
en cuatro "letras", las cuatro bases nitrogenadas adenina (A),
guanina (G), citosina (C) y timina (T).
Se abría en principio una nueva manera de estudiar la base genética
de los seres vivos: de dentro (genotipo) a fuera (fenotipo), al revés
de lo que se venía haciendo desde Mendel (la observación de
la transmisión del genotipo permitía inferencias sobre el
genotipo).
A continuación
se abre un decenio llamado a menudo la "Edad de Oro de la Biología
Molecular", que pone las bases de la comprensión de los procesos
básicos de la herencia y de la expresión genética:
replicación
del ADN: papeles de la ADN-polimerasa, los cebadores (primers), el molde.
Transcripción:
una de las cadenas de ADN es copiada por la ARN-polimerasa hasta un ARN
mensajero
El
ARN mensajero es leído (traducido) por los ribosomas para dar una
proteína. De este modo, el mensaje lineal del ADN se convierte en
el mensaje tridimensional de la configuración de la proteína
El "Dogma Central" de
la Biología Molecular: la información fluye unidireccionalmente
en sentido ADN -> ARN -> proteína.
El desciframiento del código
genético: el lenguaje del ADN consta de "palabras" de tres
letras (nucleótidos), llamadas codones. Cada codón tiene un
equivalente en el lenguaje de la proteína, significando uno de los
20 aminoácidos. El código genético está "degenerado",
es decir, tiene cierto grado de redundancia: algunos de los aminoácidos
pueden venir determinados por más de un codón. Existen 64
codones, de los cuales tres carecen de sentido: no tienen equivalente aminoácido,
y en vez, sirven como señales de parada de la traducción del
mensajero.
Jacob
y Monod estudian en profundidad un sistema de expresión y regulación
genética en la bacteria Escherichia coli: desarrollan su concepto del operón, como unidad de expresión
y regulación a nivel de transcripción.
Tras la "Edad de Oro", empiezan a surgir algunas sorpresas que
desafiaban ideas fuertemente establecidas:
Los genes eucarióticos
son "discontinuos": están compuestos por una alternancia
de segmentos que entrarán a formar parte del ARNm maduro (exones)
y segmentos que se eliminan (intrones). Este proceso de maduración
del ARN se denomina corte-y-empalme (splicing).
Algunos virus (retrovirus)
poseen material genético de ARN, que es convertido a ADN por una
enzima llamada reversotranscriptasa.
Se confirman los tempranos (y semiolvidados) estudios de Barbara McClinctock:
hay segmentos del material genético capaces de moverse de un lado
a otro de los genomas (elementos genéticos transponibles). El material
genético es más dinámico y cambiante de lo que se había
sospechado.
Pero aparte de estos
avances básicos, a finales de los años 60, seguía pendiente
de plasmación una de las expectativas abiertas por el descubrimiento
de la estructura del ADN: ¿cómo llegar a "tocar"
el ADN?, ¿cómo estudiar cada gen por separado, aislándolo
físicamente de los demás?, ¿cómo determinar
su secuencia de bases?
Durante mucho tiempo, lo único que se
podía secuenciar era ARN:
desde 1964 se secuencian algunos ARN
transferentes, que constan de 75 a 85 bases.
Los métodos se fueron perfeccionando, de modo que en 1975 se pudo
conocer la secuencia de un minúsculo genoma: el ARN del virus bacteriano
Fi-X-174 (unos 4000 nucleótidos)
Sin embargo, para estudiar
genes había que ser capaces de aislarlos uno a uno a partir del cromosoma,
que es demasiado grande para su manipulación inmediata. Pero no se
habían descubierto nucleasas específicas capaces de cortar
en puntos determinados del ADN para generar fragmentos discretos y homogéneos.
Ante este estado de cosas, algunos líderes de la Edad de Oro, consideraron
que los problemas básicos de la biología molecular estaban
resueltos, y decidieron migrar a otras áreas de conocimiento (biología
del desarrollo, neurobiología, etc).
Como tantas veces ocurre
en la ciencia, fue una humilde línea de investigación básica
la que abrió definitivamente el camino a la manipulación del
ADN:
En 1953 se descubrió el fenómeno llamado de restricción:
ciertos fagos (virus bacterianos) que parasitan a E.
coli podían desarrollarse en ciertas cepas
de esta bacteria, pero no podían hacerlo en otras (se dice que están
"restringidos" en determinadas cepas).
A finales de los 60, Werner Arber, en Basilea, descubre las enzimas de restricción
responsables de ese fenómeno: la cepa de bacteria restrictiva produce
unas endonucleasas ("enzimas de restricción, o restrictasas")
que escinden el ADN del fago crecido en otra cepa diferente.
Esas primeras enzimas de restricción eran inespecíficas en
cuanto al sitio del ADN donde cortaban, pero en 1970 Hamilton Smith, en
Baltimore, descubre un nuevo tipo de enzima de restricción totalmente
específica: capaz de reconocer una determinada secuencia de ADN,
de unos pocos pares de bases, y de cortar en ambas cadenas en lugares concretos.
Algunas restrictasas reconocen
como secuencia diana un trecho de 4 pares de bases (pb).
Otras restrictasas reconocen secuencias de 6 pares de bases.
Se han descubierto restrictasas que cortan tras reconocer secuencias más
largas.
Las dianas de la mayoría
de las restrictasas de este tipo son secuencias palindrómicas, es
decir, "capicúas" (nota: la ´ señala el punto
de corte). Ej:
5'-G´GAACC-3'
3'-GGTTG´G-5'
Muchas de estas restrictasas cortan en cada cadena en lugares
separados del centro geométrico de la diana (como en el ejemplo anterior),
de modo que generan extremos protuberantes.
Los extremos protuberantes de distintos fragmentos de ADN generados
con la misma restrictasa (incluso de fragmentos de especies distintas),
tienen tendencia, al mezclarlos, a emparejarse entre sí por puentes
de hidrógeno (siguiendo las reglas de emparejamiento A-T y G-C).
Si ahora añadimos la enzima ADN-ligasa a la mezcla de fragmentos
de ADN de orígenes diferentes, se repararán los enlaces fosfodiésteres.
Esto es lo que realizaron por primera vez Mertz y Davis en 1972, y enseguida
se dan cuenta de que ello podía constituir la base para la
producción de moléculas recombinantes in
vitro, con material genético de diferentes
especies.
Pero este ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, es
inerte, no es más que una macromolécula híbrida que
por sí sola no hace nada.
Si queremos que el ADN recombinante haga algo, hay que introducirlo
en células vivas que sean capaces de expresar su información
genética.
Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniería Genética: la formación in vitro de nuevas combinaciones de material genético, por medio de la inserción de un ADN de interés en un vehículo genético (vector), de modo que tras su introducción en un organismo hospedero el ADN híbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.
2.2.2 La receta básica de un experimento de Ingeniería Genética
Vamos a ilustrar el concepto de la ingeniería genética
con el caso bastante fácil de lograr bacterias que hospeden nuevas
combinaciones de ADN:
Partimos de ADN que queremos aislar y estudiar:
vamos a llamarlo ADN pasajero
Por otro lado, necesitamos un vehículo genético
para transportar y replicar ese ADN: lo llamamos vector. Los vectores son
igualmente moléculas de ADN con capacidad de replicarse por sí
mismos o de insertarse una vez que se introducen en el organismo adecuado.
He aquí una lista de lo que debe poseer idealmente un vector genético:
capacidad
de replicación autónoma (es decir, se trata de un replicón),
o de integración en el genoma del hospedero.
Marcadores seleccionables:
se trata de genes que confieren algún rasgo que se puede rastrear
o seleccionar fácilmente en laboratorio. Unos de los más usados
son los genes que confieren resistencia a algún antibiótico.
Dianas únicas para
al menos una enzima de restricción. En los modernos vectores se ha
introducido un trecho de ADN, denominado polilinker, provisto de varias dianas únicas para diferentes enzimas
de restricción, de modo que en cada experimento se pueda elegir la
que más convenga.
Finalmente, contamos con el
organismo anfitrión o huésped. En los primeros tiempos de
la I.G. se manipulaban casi exclusivamente bacterias, pero hoy es posible
modificar animales y plantas.
Así, pues, el "retrato robot" de un experimento de I.G. podría ser como sigue:
Se corta por separado el ADN del organismo a estudiar y el ADN del vector con la misma restrictasa, de modo que se generan extremos compatibles entre sí (mutuamente cohesivos).
Se juntan ambos ADNs y se les añade ADN-ligasa: de esta forma, las uniones entre ADN pasajero y ADN del vector se sellan covalentemente, generándose moléculas híbridas (quiméricas o recombinantes).
Ahora hay que introducir las moléculas generadas en el organismos huésped. En el caso de bacterias se recurre a una técnica sencilla denominada transformación, que permite la entrada del ADN a través de las envueltas del microorganismo.
Finalmente, hay que localizar las bacterias que han captado y han establecido establemente las moléculas híbridas. A menudo este es el paso más laborioso, pero el hecho de que el vector posea uno o varios genes de resistencia favorece al menos la eliminación de las bacterias que no han recibido ADN del vector: basta añadir al medio de cultivo el antibiótico para el que el vector confiere resistencia. Para localizar los transformantes recombinantes, muchos vectores incorporar un gen marcador que produce alguna sustancia coloreada. Si insertamos el gen a aislar dentro de ese marcador, lo rompemos, por lo que las colonias bacterianas no producirán la sustancia coloreada, sino que permanecen incoloras o blancas.
El resultado del experimento es la obtención de al menos una colonia (clon) de bacterias que portan la combinación buscada de vector con el inserto de ADN pasajero. Se dice entonces que hemos clonado (=aislado) dicho ADN.
El primer experimento de este tipo lo realizaron en 1973 Stanley Cohen y Herbert Boyer en la Universidad de California. Se vio que era factible hacer toda clase de experimentos en los que se recombina ADN de organismos totalmente diferentes (bacterias, plantas, animales).
2.2.3 Caracterización del ADN clonado
Una vez que se ha clonado un gen o trozo de ADN, hay que caracterizarlo
lo más detalladamente posible:
Lo primero que se suele hacer es realizar un "mapa físico".
Para ello, muestras independientes del ADN clonado son sometidas a distintas
enzimas o combinaciones de enzimas de restricción, y los fragmentos
resultantes se separan por tamaños usando la electroforesis en gel
de agarosa con la sustancia fluorescente bromuro de etidio, revelándose
en forma de bandas visibles bajo luz UV. A partir de los tamaños
de las bandas generadas por las distintas enzimas y combinaciones de enzimas,
es posible ensamblar el rompecabezas del fragmento, determinando un mapa
donde se van colocando las localizaciones relativas de las distintas dianas
de las restrictasas.
A partir de la subclonación de fragmentos del trozo original,
es posible, en algunos casos, ir adjudicando funciones a cada subfragmento,
lo cual va generando en paralelo un "mapa genético".
El último nivel (el más detallado) de caracterización
física es la misma secuenciación del ADN.
En los primeros
tiempos se usaba sobre todo el "método químico"
de Maxam y Gilbert
Pero el más usado actualmente es el método de terminación
de cadena mediante didesoxinucleótidos (método enzimático
de Sanger).
Una modificación del método de Sanger permite la secuenciación automática mediante lectura fluorimética computerizada.
2.2.4 Otros métodos básicos
2.2.4.1 Síntesis química de ADN
Actualmente existen máquinas programables para sintetizar rápidamente secuencias determinadas de más de 100 nucleótidos. Se usan a menudo para generar sondas moleculares en la búsqueda y caracterización de determinados segmentos de ADN, y sobre todo para producir los cebadores usados en la reacción en cadena de la polimerasa.
2.2.4.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los años 80.
Como ya sabemos, muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN concreto "perdido" en la inmensidad del genoma. Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier trecho de ADN, supuesto que se conocen las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva".
El principio que sustenta la PCR
El ADN de cadena doble que se quiere amplificar se calienta casi
hasta ebullición, de modo que se separan las dos cadenas, las cuales
van a servir de moldes más adelante.
Se añaden dos cebadores (normalmente fabricados por síntesis
química; ver apartado 2.2.4.1). Cada cebador es un corto oligonucleótido,
correspondiente a una de las secuencias que flanquean el trozo a amplificar.
Al bajar la temperatura, cada cebador se empareja por puentes de hidrógeno
con la secuencia complementaria de una de las cadenas del molde, y obligará
a la ADN-polimerasa a comenzar la copia de esa cadena molde complementaria
(por supuesto, en sentido 5'->3')
Al añadir la ADN-polimerasa y los 4 tipos de desoxinucleósido-trifosfato
(dNTPs), se produce la síntesis de las respectivas cadenas complementarias
de cada molde, a partir de los respectivos cebadores. Al final de esta fase,
tenemos el doble de cadenas de ADN de doble cadena respecto a las de partida.
Luego la mezcla se vuelve a calentar hasta casi ebullición,
con lo que se vuelven a separar la cadenas, que en su forma de cadenas sencillas
sirven para iniciar otro ciclo idéntico al anterior, al final del
cual tendremos el cuádruple de ADN.
Si repetimos el protocolo n ciclos, el resultado será 2n copias a partir de las originales.
La técnica básica de la PCR
El ADN a usar no precisa ser purificado.
La cantidad de partida puede ser minúscula (<1 microgramo
de ADN genómico). De hecho se puede amplificar a partir de una sola
molécula de molde.
El empleo de ADN-polimerasas termorresistentes, como la Taq (procedente de la bacteria Thermus aquaticus descubierta junto a los géiseres de Yellowstone), evita tener que añadir polimerasa nueva en cada ciclo de amplificación.
En resumidas cuentas, el experimento suele realizarse según este orden:
En un tubito se mezcla el ADN molde, los dos cebadores (oligonucleótidos), los cuatro dNTPs y la ADN-polimerasa termorresistente.
Se calienta a 94ºC durante 5 min, con lo que se separan las cadenas del ADN molde a amplificar, generándose las correspondientes cadenas sencillas.
Se baja la temperatura en torno a los 60ºC, de modo que cada cebador se empareja con el extremo correspondiente de una de las cadenas del molde. Se dice que ahora tenemos los moldes cebados.
Se sube la temperatura hasta 72ºC (la óptima de funcionamiento de la Taq), y se deja durante 5 min, tiempo durante el que se está produciendo la síntesis in vitro de las cadenas complementarias de cada hebra molde.
Se sube la temperatura a 94ºC durante 20 segundos, suficientes para separar la cadena recién sintetizada respecto del molde original.
Las cadenas sencillas generadas entran ahora en un nuevo ciclo (pasos 1 al 5), y así sucesivamente, de modo que tras 30-60 ciclos obtenemos una amplificación del ADN original de millones o miles de millones de veces.
Todo este proceso se realiza en unos aparatos automáticos llamados termocicladores, en los que se pueden fijar los parámetros de tiempos y temperaturas de cada paso del ciclo. El método de PCR fue patentado en 1987, y en principio fue comercializado por la empresa Cetus, si bien desde 1991 los derechos fueron adquiridos por Hoffman-La Roche y Perkin Elmer. Las ganancias de este método tan universalmente empleado son astronómicas.
Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prácticamente
ilimitadas:
simplifica sobremanera muchos experimentos de I.G.
permite muchos estudios de expresión genética
secuenciación directa de secuencias amplificadas
detección de mutaciones
seguimiento
de la efectividad de tratamiento de enfermedades
diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas
en ciencia forense: identificación de restos biológicos,
determinación de paternidad, pruebas periciales en criminalística
en arqueología y paleontología
La bibliografía sobre biotecnología e I.G.
es inmensa. Para un acercamiento a su alcance y principales técnicas,
recomiendo:
CRUEGER, W, CRUEGER, A. (1993): Biotecnología. Manual de Microbiología Industrial, Ed. Acribia, Zaragoza.
GLICK, B.R y J.J. PASTERNAK (1998): Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA (2ª edición), ASM Press (ISBN: 1-55581-136-1).
IZQUIERDO ROJO, M. (1999): Ingeniería genética y transferencia génica. Madrid: Ediciones Pirámide (ISBN: 84-368-1312-X).
SMITH, J.E. (1996): Biotechnology (3ª edición). Cambridge: Cambridge University Press (ISBN: 0-521-44911-1).
Última actualización: jueves 24 de mayo de 2001
© Enrique
Iáñez. Prohibida la reproducción
comercial y el uso fraudulento.
El autor agradecerá remitan
notificación del empleo educativo o divulgativo de este material.
|
|
|
|
|
|
|
